Technical Information Nucleic Acids Delivery

Background

Background肝臓特異的なリガンド、GalNAcを用いて、siRNAを肝臓にデリバリーできるなら、他のリガンドを用いれば肝臓以外の臓器にデリバリーできると考え、リガンドとして抗体を利用することにしました。

 

Particle size might hinder CD71-targeting potential

Particle size might hinder CD71-targeting potential組織にデリバリーする抗体として、抗CD71抗体を用いました。特に留意した点は、二価性の抗体による受容体の架橋を回避し、正常な血管を透過できるよう、出来るだけ小さなプラットフォームにすることでした。そうしなければ、例え標的臓器にCD71が高発現していたとしても、到達出来ないと考えたからです。具体的には抗体からFc領域を切断した後、還元しFab’を調製し、マレイミド修飾したsiRNAとconjugationしました。

 

Affinity / Resistance against natural Tf

Conjugationしても、リコンビナントCD71タンパク質に親和性があることをELISAで確認しました。

 

Affinity  /  Resistance against natural Tf

 

In vitro knock-down activities against CD71-positive cells

モデル実験としてHPRT に対するsiRNA(siHPRT)をconjugationしており、in vitroでのトランスフェクション活性があることを、マウス脾臓B細胞、T細胞でのHPRTのノックダウンで確認しました。アイソタイプコントロールIgGを conjugationしてもその効果は弱いことから、抗体依存的にノックダウンが亢進したことがわかりました。

 

In vitro knock-down activities against CD71-positive cells

 

In vivo KD activities of anti-CD71 siHPRT (intravenous administration)

in vivo でのノックダウン効果を調べるため, 10 mg/kg で 抗CD71 siHPRT conjugate を静脈内投与したところ、ふくらはぎや心臓でHPRTのノックダウンが観察されました。これは各臓器でのCD71の発現に比例しました。肝臓以外でノックダウンが明確に観察されることは希であったので、より検討を進めました。

 

In vivo KD activities of anti-CD71 siHPRT (intravenous administration)

 

1 month silencing with Single i.v. Injection

Silencingの持続性を確認するため、単回投与後、2週、3週、4週でのHPRTの発現を調べたところ、持続的なHPRTの発現抑制効果が観察されました。これは、別配列のsiRNA siNCをconjugationしたconjugateでは観察されませんでした。

1 month silencing with Single i.v. Injection

 

Direct Application: Intramuscular Injection

腓腹筋が標的の場合は、筋肉内注射を行うことが、投与量を抑える観点から有用と考えました。前頁では、約200μg/マウスでの投与でしたましたが、1μg/leg での筋肉内投与を実施したところ、抗CD71 siHPRT のみが、HPRTのノックダウンを惹起しました(右上)。投与量を40μgに増量するとノックダウンはより強くなりました。siNC conjugateでは活性は認められませんでした。

Direct Application: Intramuscular Injection

 
 

Evidence of Therapeutic Effect

この新規のデリバリープラットフォームを用いて、筋疾患を治療可能かを調べることにしました。プラットフォームの一般性を示すため、ここでは出来るだけ common diseaseを対象としました。

Peripheral Artery Disease (PAD)

Peripheral Artery Disease (PAD) を選択しました。この疾患では、高齢や肥満などにより、下肢の動脈硬化が進むにつれ、血流が落ち、骨格筋の疲弊が進むにつれ、間欠性跛行と呼ばれる歩行痛が生じてきます。加齢が危険因子であることから、非常に多くの方が罹患しますがPADモデルマウスに効果のある治療法は、RNAi療法に限らず、文献が殆ど無い状態でした。

Peripheral Artery Disease (PAD)
What is the effective treatment for PAD?

It is NOT limited to RNAi Therapy, so far few experimental reports have been found improving the running performance of PAD model mice.

 

PAD model mice and Study design

両足FAL手術でPADモデルマウスを作製後、 抗CD71 ミオスタチンsiRNA conjugate (anti-CD71 siMSTN) を腓腹筋に注射して走行距離を測定しました。

PAD model mice and Study design

 

Phenotypic Changes in PAD mice

その結果、腓腹筋でのミオスタチン発現は72%低下し、腓腹筋重量は17%増加しました。また、走行距離は増加し、PADマウスに治療効果が確認されました。

Phenotypic Changes in PAD mice

 

Summary

従来GalNAcで示されていたのと同様に、核酸を積極的に細胞内に取り込ませる手法は、肝臓以外でも有用であることがわかりました。肝臓以外の臓器で、siRNAが病態モデルに治療効果を示したのは大変貴重な事例と思われます。白血球、骨格筋、心筋はもちろんですが、この様な手法に興味を持ち、共同で研究を行えるパートナーを募集中です(本技術のIPは、既に武田薬品から弊社に譲渡されています)。

  • Anti-CD71 antibody conjugates were applied for siRNA delivery to muscular tissues.
  • Robust and Durable gene silencing has been observed in heart and skeletal muscle after systemic administration of siRNA conjugates.
  • Intramuscular injection has also enabled robust and local gene silencing in gastrocnemius.
  • This delivery platform will open new applications of siRNAs especially in muscular tissues.
  • GenAhead Bio is looking forward to having a future of research and development partnership with pharmaceutical companies in this fields.